Tim ilmuwan internasional dari Amerika Serikat, Prancis, dan Cina telah menciptakan bentuk kehidupan semi-sintetik. Meskipun upaya untuk mendapatkan bakteri dengan DNA yang dimodifikasi telah dilakukan, mikroorganisme berkembang biak dengan buruk, memerlukan kondisi pertumbuhan khusus, dan akhirnya menyingkirkan modifikasi yang dimasukkan ke dalamnya. "Lenta.ru" berbicara tentang sebuah karya baru di mana para peneliti berhasil memecahkan masalah ini, setelah memperoleh makhluk yang sangat berbeda dari semua kehidupan alami di Bumi.
Baru-baru ini, DNA semua organisme hidup di planet kita terdiri dari empat jenis nukleotida yang mengandung adenin (A), timin (T), atau guanin (G), atau sitosin ©. Untaian puluhan atau ratusan juta nukleotida membentuk kromosom terpisah. Gen yang ditemukan pada kromosom pada dasarnya adalah urutan nukleotida yang panjang di mana urutan asam amino protein dikodekan. Kombinasi tiga nukleotida berurutan (kodon atau triplet) sesuai dengan salah satu dari 20 asam amino. Jadi, kehidupan menggunakan kode genetik tiga huruf (ATG, CGC, dan seterusnya) berdasarkan alfabet empat huruf (A, C, T, G).
Ketika sel suatu organisme membutuhkan protein (polipeptida), gen yang mengkodekannya diaktifkan. Yang terakhir melekat pada enzim khusus yang disebut RNA polimerase, yang, selama proses transkripsi, mulai mengikuti urutan nukleotida dan membuat salinannya dalam bentuk molekul yang disebut messenger RNA (mRNA). RNA sangat mirip dengan DNA, tetapi alih-alih timin, RNA mengandung urasil (U). Setelah itu, mRNA meninggalkan inti sel dan diarahkan ke ribosom, di mana selama proses translasi berfungsi sebagai resep untuk membuat rantai asam amino protein.
Para peneliti memutuskan untuk mengubah kode genetik Escherichia coli dengan menambahkan dua "huruf" tambahan padanya. Faktanya adalah bahwa DNA dalam organisme hidup itu ganda, yaitu dibentuk oleh dua rantai yang dipasangkan satu sama lain oleh ikatan komplementer. Ikatan semacam itu terbentuk antara basa nukleotida-A dari satu untai dan basa nukleotida-T dari untai lainnya (demikian pula antara C dan G). Itulah mengapa dua nukleotida sintetis baru juga harus dapat berpasangan secara komplementer. Pilihannya jatuh pada dNaM dan d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Foto: Laboratorium Rocky Mountain / NIAID / NIH
Sepasang nukleotida sintetis dimasukkan ke dalam plasmid - molekul DNA melingkar untai ganda yang mampu berkembang biak secara terpisah dari genom bakteri lainnya. Mereka mengganti sepasang nukleotida komplementer A dan T, yang merupakan bagian dari operon laktosa - satu set gen yang memetabolisme gula laktosa, dan sekuens DNA non-coding yang terkait dengannya. Nukleotida sintetis tidak termasuk dalam wilayah yang disalin polimerase dalam mRNA.
Video promosi:
Mengapa para ilmuwan memutuskan untuk tidak memasukkan nukleotida sintetis langsung ke dalam gen, tetapi di sebelahnya? Faktanya adalah sangat sulit untuk mengubah gen dengan cara ini agar tetap berfungsi. Lagi pula, untuk ini Anda perlu mengikat kodon baru yang dihasilkan ke asam amino apa pun. Untuk ini, pada gilirannya, perlu diajarkan sel untuk menghasilkan berbagai jenis transpor RNA (tRNA), yang dapat mengenali kodon ini.
Molekul tRNA melakukan fungsi berikut. Mereka, seperti truk, membawa asam amino tertentu di satu ujung, mendekati mRNA di ribosom dan, pada gilirannya, mulai mencocokkan triplet nukleotida di ujung lain dengan kodon. Jika cocok, asam amino dilepaskan dan dimasukkan ke dalam protein. Namun, jika tidak ada tRNA yang sesuai, protein tidak akan disintesis, yang dapat berdampak negatif pada viabilitas sel. Oleh karena itu, dengan memasukkan nukleotida sintetis ke dalam gen, para ilmuwan harus membuat gen yang menyandikan tRNA baru yang dapat mengenali kodon buatan dan menempelkan asam amino yang benar ke polipeptida. Namun, tugas peneliti lebih sederhana. Mereka perlu memastikan bahwa plasmid dengan nukleotida sintetis akan berhasil berkembang biak dan diteruskan ke organisme anak.
Plasmid digunakan untuk mengubah Escherichia coli
Gambar: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Alam / Departemen Kimia / The Scripps Research Institute
Plasmid ini, disebut pINF, dimasukkan ke dalam E. coli. Namun, untuk menyalinnya, perlu ada banyak nukleotida yang ada di dalam sel bakteri. Untuk tujuan ini, plasmid lain, pCDF-1b, dimasukkan ke dalam E. coli. Itu mengandung gen untuk diatom Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, yang mengkode protein NTT, yang mengangkut nukleotida dari media nutrisi ke dalam sel.
Namun, para ilmuwan menghadapi sejumlah kesulitan. Pertama, protein Phaeodactylum tricornutum memiliki efek toksik pada sel E. coli. Semua karena adanya fragmen urutan asam amino di dalamnya, yang membawa fungsi pensinyalan. Berkat dia, protein mengambil posisi yang benar di sel alga, setelah itu urutannya dihilangkan. E. coli tidak dapat menghilangkan fragmen ini, jadi para peneliti membantunya. Mereka mampu menghilangkan 65 asam amino pertama dari NTT. Ini secara signifikan mengurangi toksisitas, meskipun juga mengurangi laju transpor nukleotida.
Masalah lain adalah nukleotida sintetis disimpan dalam plasmid untuk waktu yang lama, dan tidak diganti saat DNA disalin. Ternyata, keamanannya bergantung pada nukleotida apa yang mengelilingi mereka. Untuk mengetahuinya, para ilmuwan menganalisis berbagai kombinasi yang tertanam dalam 16 plasmid. Untuk memahami apakah nukleotida sintetis telah keluar dari urutannya, para peneliti menggunakan teknologi CRISPR / Cas9.
CRISPR / Cas9
Gambar: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 adalah mekanisme molekuler yang ada di dalam bakteri dan memungkinkan mereka melawan bakteriofag. Dengan kata lain, teknologi ini mewakili kekebalan terhadap infeksi virus. CRISPR adalah bagian khusus dari DNA. Mereka mengandung fragmen pendek virus DNA yang pernah menginfeksi nenek moyang bakteri masa kini, tetapi dikalahkan oleh pertahanan internal mereka.
Ketika bakteriofag memasuki bakteri, fragmen ini digunakan sebagai cetakan untuk sintesis molekul yang disebut crRNA. Banyak rantai RNA yang berbeda terbentuk, mereka mengikat protein Cas9, yang tugasnya memotong DNA virus. Dia dapat melakukan ini hanya setelah crRNA menemukan fragmen komplementer dari DNA virus.
Jika, alih-alih crRNA, urutan RNA yang melengkapi fragmen plasmid tertentu digunakan, maka Cas9 akan memotong plasmid juga. Tetapi jika terdapat nukleotida sintetik pada fragmen tersebut, maka protein tidak akan bekerja. Jadi, dengan menggunakan CRISPR, dimungkinkan untuk mengisolasi plasmid yang resisten terhadap mutasi yang tidak diinginkan. Ternyata pada 13 dari 16 plasmid, kehilangan nukleotida sintetis tidak signifikan.
Dengan demikian, para peneliti berhasil menciptakan organisme dengan perubahan mendasar pada DNA, yang mampu mempertahankannya sendiri tanpa batas.
Meskipun bentuk kehidupan semi-sintetik hanya memiliki dua nukleotida tidak alami dalam genomnya, yang tidak ditemukan dalam kodon dan tidak terlibat dalam pengkodean asam amino, ia adalah organisme resisten pertama yang alfabet DNA-nya terdiri dari enam huruf. Di masa depan, para ilmuwan kemungkinan besar akan dapat menggunakan inovasi ini untuk mensintesis protein, sehingga menciptakan kode genetik buatan yang lengkap.
Alexander Enikeev
