Sampel jaringan mumi bernama "Maria" dan "Vavita" dikirim dari Peru ke laboratorium Rusia untuk penelitian. Sampel jaringan biologis yang disediakan dipelajari dengan menggunakan mikroskop elektron scanning, spektrum Raman, ICPE, komposisi tanah diatom (zat pada permukaan kulit mumi) dipelajari. Sebuah studi tentang DNA dari jaringan yang ditransfer juga dilakukan.
Persiapan sampel
Sampel jaringan, masing-masing 500 μg, dipindahkan ke dalam tabung plastik dan dilarutkan dalam 1 ml buffer (10 mM Tris-HCl pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Untuk suspensi yang dihasilkan, Na dodesil sulfat ditambahkan ke 0,5%, dipanaskan sampai +80 C, dan setelah 10 menit, proteinase K (sampai 500 μg / ml) ditempatkan dalam termostat (+55 C) selama 24 jam.
Deproteinisasi dilakukan dengan metode fenolik: menambahkan fenol dengan volume yang sama ke suspensi, kemudian fenol: kloroform (1: 1), kloroform; setelah setiap penambahan, pengadukan konstan dilakukan pada rotor sudut dan sentrifugasi pada 15 ribu rpm, 10 menit.
Untuk super-sedimen yang diperoleh setelah sentrifugasi ke-3 ditambahkan 1/10 bagian dari volume 1 M NaCl dan 2,5 volume dari dua kali suling etil alkohol, dan dibiarkan semalam pada suhu -30 C dalam tabung reaksi berbentuk kerucut - "Eppendorf". Sentrifugasi dilakukan pada 15 ribu vol. min. dalam 10 menit dan menerima DNA "diendapkan" dalam bentuk endapan coklat. Pellet DNA dicuci dua kali dengan etil alkohol 70% dan dikeringkan pada suhu kamar (1 jam) dan kemudian dilarutkan dalam buffer TE.
PCR dilakukan pada sepeda termal terprogram "My Cycler" ("Bio = Rad") menggunakan oligoprimer standar yang disintesis dengan metode fase padat di asosiasi "Beagler" (St. Petersburg). Campuran reaksi untuk amplifikasi dengan volume 25 μL meliputi: 15 nM tiap oligoprimer, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 pada +25 C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 mercaptoethanol, 170 μg / ml BSA dan campuran empat dNTP dasar pada konsentrasi masing-masing 1,0 mM dan DNA polimerase Thermus thermophilis (5 U / μl) termostabil (NPO SibEnzim). Setelah denaturasi (10 menit, 94 C), 35 siklus amplifikasi dilakukan untuk setiap sistem pengujian: 94 ° C -1 menit, 58 ° C - 1 menit, 72 ° C - 1 menit. Untuk mengontrol spesifisitas, sampel DNA dengan genotipe yang diketahui untuk lokus yang dipelajari (sistem penanda), serta sampel kontrol, dimasukkan ke dalam reaksi.mengandung campuran reagen tanpa DNA. Setelah amplifikasi, buffer pewarnaan ditambahkan ke alikuot dari campuran reaksi (7 μl) dan dipisahkan dengan elektroforesis vertikal dalam gel poliakrilamida 6% (210x150x1 mm), diwarnai dengan etidium bromida dan difoto di bawah sinar ultraviolet. Untuk mengidentifikasi alel, standar alel yang sesuai dengan lokus ini ("tangga") digunakan.
Video promosi:
Analisis DNA
Untuk studi tersebut, kami menggunakan metode analisis exome DNA manusia berdasarkan sekuensing throughput tinggi dengan pengayaan melalui hibridisasi.
Teknik analisis exome DNA manusia.
2 sampel dianalisis … Semua tahap persiapan sampel sebelum PCR dilakukan di ruang bersih. Persiapan sampel, ekstraksi DNA, dan amplifikasi fragmen DNA individu dilakukan di ruangan yang berbeda.
Adaptor khusus (Kit Persiapan Perpustakaan KAPA dan Kit Adaptor SeqCap; Roche) diikat ke ujung DNA terfragmentasi genomik (~ 5 ng), setelah itu pemilihan fragmen dua tahap dalam rentang panjang 200-350 bp dilakukan menggunakan Manik-manik AMPureXP (Beckman Coulter) … Fragmen yang dihasilkan diperkuat dengan primer khusus adaptor dan dihibridisasi dengan probe spesifik yang dibiotinilasi (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) selama 28 jam pada 47 ° C. Dalam satu reaksi, dua sampel DNA digabungkan. Hibrida DNA-probe terbiotinilasi diisolasi dan dimurnikan dengan partikel magnetik terkonjugasi streptovidin; amplifikasi kedua dan penilaian kualitatif dari perpustakaan DNA yang dihasilkan dilakukan (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Untuk menghilangkan fragmen amplifikasi dari target dan dimer adaptor, pustaka DNA dimurnikan ulang menggunakan partikel magnet AMPureXP Beads (Gbr. 1). Konsentrasi akhir dari pustaka yang disiapkan dievaluasi pada instrumen Quantus menggunakan kit Sistem QuantiFluor® dsDNA komersial (Promega). Perpustakaan DNA yang dihasilkan diimobilisasi ke permukaan sel aliran. Pengurutan dilakukan pada platform Illumina menggunakan Standard Flow Cell dan MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 siklus). Perpustakaan DNA yang dihasilkan diimobilisasi ke permukaan sel aliran. Pengurutan dilakukan pada platform Illumina menggunakan Standard Flow Cell dan MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 siklus). Perpustakaan DNA yang dihasilkan diimobilisasi ke permukaan sel aliran. Pengurutan dilakukan pada platform Illumina menggunakan Standard Flow Cell dan MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 siklus).
Angka: 1
Penilaian umum kualitas DNA yang diurutkan
Metode standar seperti FastQC dan program Ubur-ubur dan KraTER digunakan untuk penilaian kualitas awal. Penilaian kualitas menunjukkan tidak ada masalah kualitas dengan pembacaan DNA yang diurutkan untuk kedua sampel. Gambar tidak ditampilkan karena tidak informatif.
Untuk sampel pertama (selanjutnya M, mumi besar "Maria") 113,4 juta pembacaan diurutkan, untuk sampel kedua (selanjutnya W, mumi kecil "WaWita") 22,9 juta pembacaan diurutkan.
Langkah selanjutnya adalah membersihkan pembacaan berurutan dari berbagai urutan teknis yang akan mengganggu analisis lebih lanjut. Untuk ini, program Cookiecutter digunakan. Setelah pembersihan, ada 113,3 juta (99%) pembacaan dan 22,8 juta (99%) pembacaan, untuk M dan W.
Estimasi jumlah DNA purba dan pemisahannya dari modern
Metode standar untuk menilai keberadaan dan jumlah DNA purba adalah memperkirakan jumlah nukleotida yang rusak karena waktu. Untuk ini, program MapDamage 2.0 digunakan. MapDamage 2.0 yang menunjukkan jumlah DNA purba dalam 30,1%, tetapi karena MapDamage menyiratkan bahwa kami menggunakan referensi yang dekat, dan kami tidak tahu persis seberapa dekat kedua sampel dengan genom manusia modern, dan kami menggunakan perpustakaan exome, metode ini sendiri tidak cukup. Metode lain yang baik untuk menilai DNA purba adalah jumlah fragmen pendek.
Filtrasi DNA purba yang diduga terjadi dalam tiga tahap. Pada tahap pertama, kami menghapus semua bacaan berpasangan yang tidak dapat disilangkan dan digabungkan menjadi satu bacaan yang tidak berpasangan dengan tumpang tindih. Pembacaan ini menunjukkan bahwa fragmen asli yang diurutkan lebih panjang dari 300 bp. dan kemungkinan besar DNA modern. Jadi setelah langkah ini, 86,9% dan 91,8% tetap sama. Setelah itu, fragmen tunggal yang tumpang tindih dipilih sehingga panjangnya lebih pendek dari 150 bp, karena ini adalah panjang yang kami harapkan untuk DNA purba. Setelah langkah ini, 8,6% dan 38,5% tetap, masing-masing, untuk sampel M dan W. Perlu dicatat bahwa meskipun terdapat perbedaan persentase, jumlah absolut pembacaan antara sampel M dan W sangat mirip: 9,8M dan 8,8M, yang dapat dijelaskan oleh fakta bahwa kandungan DNA purba di kedua sampel serupa.
| Parameter | Sampel M (Maria) | Sampel W (Wawita) |
| Jumlah bacaan | 113,3 juta | 22,8 juta |
| Persentase fragmen pendek <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Persentase fragmen pendek <150 bp (angka) |
8,6% (9.846.035) |
38,5% (8 813220) |
|
Persentase fragmen yang disejajarkan per genom manusia (angka) |
2,03% (2.345.084) |
9,65% (2.264.551) |
| Persentase fragmen yang diselaraskan per genom manusia dari pendek <150 bp | 23,8% | 25,6% |
Memperoleh DNA yang mirip dengan referensi genom manusia
DNA purba diduga yang dihasilkan dipetakan ke genom manusia referensi menggunakan pipa pencarian varian genom standar menggunakan BWA, samtools, dan Wcftools.
Selain itu, hanya 23,8% sampel M dan 25,6% yang berhasil dipetakan ke genom referensi manusia modern. Pada saat yang sama, untuk kedua sampel, 75% pembacaan sekuens tidak dapat dipetakan ke dalam genom manusia. Hal ini dapat dijelaskan baik oleh kontaminasi maupun oleh fakta bahwa sampel-sampel ini terletak cukup jauh dari genom manusia modern. Pada saat yang sama, perlu diingat bahwa kami telah mengurutkan perpustakaan exome dan dengan demikian meminimalkan kontaminasi DNA bakteri.
Analisis pengintaian awal bacaan mentah menunjukkan bahwa beberapa di antaranya termasuk dalam DNA berulang yang spesifik untuk hewan berkuku, hal ini dapat dijelaskan dengan fakta bahwa lemak llama digunakan dalam mumifikasi.
Analisis yang lebih rinci memerlukan sekitar tiga minggu perhitungan, karena solusi yang ada dibuat hanya untuk genom virus dan bakteri, dan kita perlu membandingkan dengan semua genom yang ada, termasuk genom tumbuhan, untuk memahami spesies mana yang diurutkan.
Karakteristik opsi yang ditemukan
Pembacaan yang dipetakan digunakan untuk mencari varian yang membedakan sampel M dan W dari genom manusia modern, serta untuk menilai kontaminasi pembacaan dari kromosom Y manusia.
Pertanyaan pertama yang perlu dijawab adalah ke kromosom mana pembacaan sekuens itu dipetakan.
Karena kami tahu bahwa sampel Maria diisolasi dari tulang dan otot, dan sampel Vavita hanya dari tulang, kami mengharapkan adanya perbedaan dalam jumlah mtDNA. Tapi tidak banyak perbedaannya.
Jumlah bacaan yang dipetakan di Y adalah tes lain untuk kontaminasi oleh manusia modern. Menariknya, ternyata sama di kedua sampel.
Statistik untuk varian yang ditemukan ditunjukkan di bawah ini:
| Parameter | Sampel M (Maria) | Sampel W (Wawita) |
| Jumlah opsi ditemukan | 79957 | 48941 |
| Jumlah opsi di Y | 534 | 541 |
| Jumlah opsi yang dapat diandalkan (lebih dari 20 bacaan dan lebih dari 30 kualitas) | 16969 | 6181 |
| Varian dengan rsid yang diketahui (tersedia di database snip) | 5701 | 3089 |
| Opsi umum yang valid | 92 | |
| opsi umum dengan rsid | 49 |
Setelah itu, menjadi mungkin untuk menjawab pertanyaan: apakah M dan W adalah saudara? Jawabannya adalah tidak.
Hanya 49 varian yang cocok ditemukan antara M dan W dan 3040 berbeda untuk varian dengan rsid yang diketahui. Selain itu, mungkin ini adalah jenis atau subspesies berbeda dari seseorang atau makhluk yang tidak dikenal.
Menariknya, varian dengan kromosom Y identik untuk kedua sampel, yang mengindikasikan kontaminasi oleh orang yang sama, dan bahwa dalam DNA purba kromosom Y, kemungkinan masih belum ada kromosom.
Evaluasi kemiripan dengan urutan genom manusia yang ada dari 1000 Proyek Genom Manusia
Perhatikan bahwa ini hanya analisis perkiraan, karena untuk analisis yang lebih akurat, varian diperlukan dari wilayah genom di bawah seleksi netral, dan kami memiliki data exome.
Namun demikian, dengan menggunakan 5708 varian untuk M atau 3096 untuk S, dimungkinkan untuk melakukan analisis varian dibandingkan dengan data dari 1000 genom manusia.
Hasil analisis PCA pada gambar di bawah adalah overlay dua gambar untuk M dan W, dihitung secara terpisah, karena terlalu sedikit opsi umum antara M dan W untuk memperkirakan jarak antara M dan W.
Skor kesamaan.
Seperti yang Anda lihat, tidak ada kebetulan dengan kelompok gen mana pun, mereka juga berbeda satu sama lain. Tetapi harus diingat bahwa kami menggunakan urutan pengkodean yang dipilih, dan disarankan untuk menggunakan varian di bawah pemilihan netral.
Namun demikian, hasil PCA sesuai dengan verifikasi manual varian, yang menunjukkan bahwa datanya dalam homozigot yang tidak direferensikan, yang sekali lagi menunjukkan bahwa gambar tersebut jauh dari genom manusia modern.
Kesimpulan
Sayangnya, kami dibatasi hanya pada dua sampel, biasanya dalam jenis analisis ini lebih banyak digunakan, setidaknya 3-10 setidaknya terkait. Oleh karena itu, perlu dilanjutkan penelitian dengan jumlah sampel yang banyak.
Pada saat yang sama, kami kemungkinan besar dapat menyimpulkan bahwa sampel DNA Maria dan Vavita sesuai dengan DNA manusia, tetapi tidak sesuai dengan DNA yang tersedia bagi kami dari database 1000 orang.
Penulis laporan: Baranov V. S. dan Aseev M. V. (Institut Penelitian Ilmiah Kebidanan dan Ginekologi, Departemen Diagnostik Prenatal), Glotov A. S. dan Glotov O. S. (Universitas Negeri St. Petersburg), A. S. Komissarov (Institut Sitologi, Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia, Pusat Bioinformatika Genetik).
Materi diberikan oleh Konstantin Georgievich Korotkov (Doktor Ilmu Teknik, Profesor, Universitas Teknologi Informasi, Mekanika dan Optik) dan Dmitry Vladislavovich Galetsky (Kandidat Ilmu Kedokteran, I. P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University).
Untuk informasi lebih lanjut tentang mumi Nazca, lihat tag: mumi Nazca.
