Para ilmuwan memiliki harapan tinggi untuk teknologi CRISPR / Cas9, yang memungkinkan perubahan presisi tinggi dalam genom organisme hidup, termasuk manusia. Semua artikel ilmiah baru yang diterbitkan menjelaskan berbagai jenis sistem CRISPR, serta modifikasinya. "Lenta.ru" berbicara tentang penemuan di area ini, dibuat pada tahun 2016.
Ribuan dari mereka
CRISPR / Cas9 adalah sistem kekebalan adaptif bakteri yang memungkinkan mikroorganisme melawan virus. Ini terdiri dari spacer - bagian DNA yang sesuai dengan fragmen tertentu (protospacer) dari DNA agen infeksi. Spacer menyandikan molekul crRNA spesifik yang mengikat enzim Cas9. Kompleks yang dihasilkan menempel pada rantai DNA virus, dan Cas9 bekerja seperti gunting, memotongnya.
Faktanya, CRISPR / Cas9 hanyalah salah satu dari banyak sistem serupa yang dimiliki oleh bakteri dan archaea. Ilmuwan membaginya menjadi dua kelas. Kelas pertama mencakup sistem CRISPR tipe I, III, dan IV, dan yang kedua - II dan V. Tipe II mengandung protein Cas9 yang terlibat dalam akuisisi spacer baru, akumulasi crRNA dalam sel, dan pembelahan DNA. Dalam sistem lain, kompleks multi-protein digunakan untuk tujuan ini. Hal ini menjadikan tipe II sebagai tipe sistem CRISPR yang paling sederhana yang sesuai untuk kebutuhan rekayasa genetika.
Jenis dapat, pada gilirannya, dibagi lagi menjadi subtipe tergantung pada gen tambahan mana yang dikaitkan dengan CRISPR. Jadi, sistem IIA mengandung gen csn2, yang mengkode protein yang mengikat DNA dan terlibat dalam akuisisi spacer. Dalam sistem IIB, csn2 tidak ada, tetapi ada gen cas4, yang fungsinya masih belum diketahui, dan sistem IIC tidak memiliki csn2 maupun cas4.
Harta di dalam bakteri
Video promosi:
Semua sistem CRISPR yang diketahui telah ditemukan oleh para ilmuwan pada bakteri yang tumbuh di bawah kondisi laboratorium. Namun, ada sejumlah besar mikroorganisme yang tidak dibudidayakan, termasuk archaea dan bakteri. Mereka biasanya hidup dalam kondisi ekstrim - mata air mineral atau badan air beracun di tambang yang ditinggalkan. Namun, peneliti dapat mengisolasi DNA dari mereka dan mengidentifikasi wilayah tertentu di dalamnya. Dalam makalah baru yang diterbitkan di Nature pada 22 Desember, ahli genetika di University of California, Berkeley menerjemahkan genom dari komunitas mikroba alami, menemukan variasi lain dari sistem CRISPR.
Bacteriophage - virus yang menginfeksi bakteri
Gambar: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Para ilmuwan berhasil menemukan bahwa beberapa jenis nanoorganisme mirip arche yang sedikit dipelajari juga memiliki CRISPR / Cas9, meskipun sebelumnya diyakini bahwa hanya bakteri yang memilikinya. Tercatat bahwa sistem ini menempati tempat perantara antara subtipe IIC dan IIB dan dapat berfungsi sebagai pertahanan terhadap gen parasit "melompat" (transposon) yang memasuki mikroorganisme dari archaea lain. Upaya untuk mereproduksi aktivitas archaea CRISPR / Cas9 di E. coli (Escherichia coli) tidak mengarah pada apa pun, yang menunjukkan adanya beberapa mekanisme khusus tambahan yang mengatur sistem.
Jenis sistem baru dalam kelas kedua, CRISPR / CasX dan CRISPR / CasY, juga diidentifikasi dari bakteri yang hidup di air tanah dan sedimen. Sistem CRISPR / CasX mencakup protein Cas1, Cas2, Cas4 dan CasX. Yang terakhir, seperti yang ditunjukkan oleh percobaan pada E. coli, dibedakan oleh aktivitas nuklease, yaitu mampu membelah DNA asing seperti Cas9. Namun, ini hanya terjadi jika urutan TTCN berada di depan protospacer, di mana N adalah salah satu dari empat nukleotida. Urutan seperti itu disebut PAM (motif berdekatan protospacer - motif berdekatan dengan protospacer). Sistem CRISPR / Cas9 juga memiliki PAM - NGG sendiri, yang harus ditempatkan setelah protospacer. Selain itu, CRISPR / CasY dapat memotong DNA jika terdapat urutan TA PAM di dekat lokasi target.
Apa janji dari penemuan ini? Faktanya adalah bahwa sistem yang terdeteksi adalah yang paling kompak yang diketahui saat ini. Menurut para ilmuwan, sejumlah kecil protein yang dibutuhkan untuk pekerjaan mereka membuat CRISPR / CasX dan CRISPR / CasY alat yang nyaman untuk mengedit DNA. Selain itu, penelitian metagenomik, di mana DNA yang diperoleh dari lingkungan dipelajari, akan mengungkap jenis sistem CRISPR lain yang berguna untuk rekayasa genetika.
Jalan menuju keunggulan
Tentu saja, ada alternatif untuk mencari sistem CRISPR di alam - peningkatan dari teknologi CRISPR / Cas9 yang sudah ada. Meskipun akurasinya tinggi, dia membuat kesalahan dengan memotong DNA di tempat yang salah. Hal ini menyulitkan untuk membuat perubahan yang benar pada gen dan karena itu secara efektif mengobati penyakit keturunan. Oleh karena itu, para ilmuwan sedang mencari cara untuk meningkatkan kinerja sistem. Di tahun 2016, sudah banyak karya ilmiah yang didedikasikan untuk memodifikasi CRISPR dan mengubahnya menjadi berbagai alat gen.
Protein Cas9 dan crRNA - komponen utama sistem CRISPR
Gambar: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Jadi, pada 8 Desember, jurnal Cell menerbitkan sebuah artikel oleh para ilmuwan dari Universitas Toronto, yang menciptakan "anti-CRISPR" - sebuah sistem yang mematikan mekanisme tersebut dalam kondisi tertentu. Ini memungkinkan Anda untuk menyembunyikan aktivitas Cas9 jika RNA panduan mengikat ke fragmen yang salah dan mencegah kesalahan. Anti-CRISPR terdiri dari tiga protein penghambat nuklease. Secara alami, awalnya tidak ditemukan oleh para ilmuwan, tetapi oleh virus, yang dengan demikian menetralkan kekebalan bakteri.
Pada bulan Juni, peneliti Amerika, bersama dengan rekannya dari Rusia, mengkonfirmasi bahwa sistem CRISPR / C2c2, yang diperoleh dari fusobacterium Leptotrichia shahii, mampu membelah RNA untai tunggal. Akibatnya, sistem CRISPR dapat digunakan untuk melumpuhkan - menekan fungsi - RNA pembawa pesan, yang membawa informasi dari gen ke ribosom, di mana protein disintesis berdasarkan basisnya.
Pada bulan Mei, para peneliti di University of California menciptakan teknologi CRISPR-EZ, yang memungkinkan molekul DNA baru dimasukkan ke dalam genom embrio tikus dengan keberhasilan hampir seratus persen. Sistem CRISPR / Cas9 dimasukkan ke dalam telur hewan yang telah dibuahi menggunakan jarum mikroskopis dan aliran listrik kecil. Dalam percobaan mereka, para ilmuwan berhasil memperkenalkan mutasi pada gen pada 88 persen tikus. Ini melebihi jumlah tikus hasil rekayasa genetika yang dihasilkan oleh pengeditan CRISPR, yang menggunakan suntikan konvensional.
Pada bulan April, dengan menggunakan varian mutan Cas9 yang tidak memiliki aktivitas nuklease, ahli biologi molekuler di Fakultas Kedokteran Universitas Massachusetts mengembangkan teknologi CRISPRainbow. RNA panduan, yang menunjukkan di mana enzim menempel, berisi label fluoresen, yang memungkinkan, misalnya, untuk melacak pergerakan elemen genetik seluler.
Nyamuk Anopheles mungkin menjadi korban pertama dari sistem CRISPR
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Dunia baru yang berani
Para ilmuwan telah menggunakan sistem CRISPR untuk menciptakan organisme hasil rekayasa genetika, seperti nyamuk malaria, yang menyebarkan gen berbahaya di antara kerabat liar mereka. Metode ini disebut penggerak gen. Jika salah satu orang tua seseorang adalah pembawa gen mutan, maka ia akan menularkannya kepada keturunannya dengan probabilitas 50 persen. Ini karena induk memiliki dua salinan gen tersebut, dan hanya satu yang cacat. CRISPR mampu menyalin fragmen mutan dan memasukkannya ke dalam gen yang sehat. Akibatnya, keturunannya mendapatkan mutasi dengan probabilitas 100%.
Pada 2016, para ahli dari Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) menyetujui aplikasi dari University of Pennsylvania untuk melakukan tes modifikasi genetik manusia menggunakan teknologi CRISPR / Cas9.
Namun, mereka disusul oleh orang Cina. Pada bulan November, jurnal Nature melaporkan bahwa ilmuwan China untuk pertama kalinya memperkenalkan sel dengan gen yang dimodifikasi oleh sistem CRISPR / Cas9 ke dalam manusia. Para peneliti mengekstraksi sel kekebalan (limfosit T) dari darah pasien dengan kanker paru metastatik dan kemudian menggunakan teknologi CRISPR untuk mematikan gen yang mengkode protein PD-1. Yang terakhir telah terbukti menekan kekebalan dengan mendorong pertumbuhan tumor. Ilmuwan membudidayakan sel yang diedit, meningkatkan jumlahnya, dan kemudian menyuntikkannya kembali ke tubuh manusia. Apakah terapi gen akan mengatasi penyakit masih harus dilihat.
Sistem CRISPR juga dapat digunakan untuk memerangi HIV dan penyakit keturunan manusia. Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengembangkan pengobatan yang efektif. Tentu saja, kita tidak berbicara tentang mutan, seperti dalam film fiksi ilmiah, tetapi para ilmuwan akan dapat dengan cepat menciptakan organisme hasil rekayasa genetika, seperti tanaman pertanian yang kebal terhadap parasit. Masih harus dilihat mengapa para ilmuwan yang menemukan CRISPR dan menemukan cara penggunaannya belum menerima Hadiah Nobel.
Alexander Enikeev
