Penemuan editor gen CRISPR-Cas disebut sebagai revolusi dalam biologi. Ilmuwan berjanji akan menggunakannya untuk meningkatkan varietas tanaman dan keturunan hewan untuk pertanian, untuk mengobati penyakit genetik bawaan pada manusia. Koresponden RIA Novosti pergi untuk melihat siapa dan bagaimana genom diedit.
Pusat Pengeditan Genom Universitas Negeri Moskow dibuka lebih dari setahun yang lalu - di kampus. Saya bertemu dengan direkturnya, Doktor Kimia Peter Sergiev, dan saat kami naik lift, dia mencurahkan sedikit pada sejarah rekayasa genetika.
“Genom telah diedit sebelumnya. Tapi sulit untuk membuat alat untuk ini, butuh waktu lama, dan seringkali hasilnya tidak seperti yang kami inginkan,”ujarnya.
Di vivarium, Pyotr Vladimirovich berganti pakaian laboratorium biru, mereka memberi saya terusan putih sekali pakai dan meminta saya untuk menyeka kamera dengan alkohol. Sekarang Petr Vladimirovich terlihat seperti seorang ahli bedah, dan saya - seperti asisten laboratorium dari serial "CSI - Crime Scene".
Di laboratorium steril, wadah berisi telur tikus yang telah dibuahi dan tabung reaksi dengan larutan RNA telah disiapkan untuk kita. Hanya itu yang Anda butuhkan untuk pengeditan genom CRISPR-Cas.
CRISPR adalah akronim bahasa Inggris untuk frasa yang secara harfiah berarti "pengulangan palindromik pendek yang dikelompokkan secara teratur." Faktanya, ini hanyalah potongan kecil DNA virus bakteriofag yang tertanam dalam genom bakteri. Urutan ini diperlukan agar sistem kekebalan bakteri berfungsi dan berfungsi sebagai semacam pengumuman yang "diinginkan polisi". Jika bakteri bertahan hidup setelah terinfeksi bakteriofag, ia menggunakan enzim protein Cas untuk memotong sebagian DNA-nya dan memasukkannya ke dalam genomnya untuk dikenali nanti. Genom bakteri mewarisi kumpulan "musuh" yang dikumpulkan dengan cermat oleh generasi sebelumnya.
Pada 2013, para ilmuwan menemukan bahwa protein Cas bekerja di organisme apa pun, termasuk mamalia. Dia mampu membuat pemutusan arah pada kedua untai molekul DNA dan dengan demikian mengubah genom.
Video promosi:
Manipulasi telur
Petr Sergiev membuat kapiler kaca dengan diameter seratus mikron di micro forge, menarik telur ke dalamnya dan memindahkannya ke bawah gelas dengan media nutrisi. Sampel yang sudah jadi dikirim ke tahap mikroskop optik. Monitor menampilkan gambar telur yang diperbesar, bergetar di ujung kapiler. Dua titik bulat menonjol - ini adalah pronuklei dengan DNA ibu dan ayah.
Ilmuwan menyiapkan kapiler lain dengan urutan diameter yang lebih kecil. Ini adalah jarum suntik. Ia mengumpulkan larutan dengan dua jenis RNA ke dalamnya dan, dengan bantuan manipulator, dengan lembut menembus telur. Itu saja, suntikannya sudah selesai.
RNA yang disuntikkan ke dalam telur dibutuhkan untuk memotong genom di lokasi tertentu. Satu jenis RNA mengandung urutan nukleotida yang ditentukan secara ketat, mirip dengan yang ingin kami ubah. Tugas dari RNA ini adalah menemukan daerah yang sesuai di dalam DNA, oleh karena itu disebut “pemandu”. RNA tipe kedua, matriks, adalah sejenis instruksi untuk sintesis protein nuklease Cas9. Protein ini bertindak sebagai katalisator untuk reaksi kimia yang memutus ikatan fosfodiester antara basa DNA yang terdefinisi dengan baik. Karena molekul protein memiliki dua pusat nuklease, kedua untai DNA dibuka, terlebih lagi, di tempat tersebut, koordinat Cas9 yang "dihitung" dengan RNA pemandu.
Molekul DNA menganggap kerusakan pada kedua untai sebagai kerusakan yang serius dan berusaha untuk memperbaikinya. Enzim eksonuklease yang mengapung di dalam sel segera mengeluarkan beberapa nukleotida dari kedua ujung putus. Ini cukup untuk mematahkan, atau, seperti yang dikatakan ahli genetika, "mematikan" sebuah gen.
Bagaimana editor genom CRISPR-Cas9 bekerja / Ilustrasi oleh RIA Novosti. Alina Polyanina.
Jika mutasi terarah diperlukan, misalnya, diperlukan untuk menandai protein untuk melacaknya di dalam tubuh, kemudian templat lain ditambahkan ke kompleks ke dua RNA dalam bentuk DNA yang dirancang khusus. Ini terdiri dari urutan yang identik dengan tepi break masa depan, dan juga berisi bagian yang akan disisipkan. Setelah Cas9 memotong molekul DNA, ujungnya dihubungkan menggunakan templat tambahan ini, sehingga rangkaian nukleotida yang kita butuhkan dimasukkan ke dalam pemecah.
“Kita dapat memasang ekor kecil pada tupai, yang akan memudahkan kita untuk menariknya keluar dan melihat interaksi dengannya. Kita bisa memasukkan sebuah gen, tapi itu tidak seefektif mematikannya,”lanjut ilmuwan itu menjelaskan.
GMO dan chimera
Telur yang sudah diedit akan ditransplantasikan ke dalam tabung rahim tikus pengganti. Dia tinggal untuk beberapa waktu dengan laki-laki yang tubulus seminiferus diikat. Pasangan itu memiliki kehidupan seks yang normal, tetapi tidak bisa hamil. Namun demikian, tubuh tikus percaya bahwa dia hamil, dan membentuk latar belakang hormonal yang sesuai untuknya. Sekarang wanita ini mengandung janin orang lain.
Dalam tiga minggu dia akan melahirkan tikus paling biasa. Para ilmuwan akan menunggu sampai hewan pengerat tersebut tumbuh dewasa, mengambil sebagian kecil ekornya dan menggunakan PCR untuk menganalisis potongan DNA yang mereka edit. Mutasi atau gen yang cacat ditemukan di lebih dari setengah kasus. Prosedur sebaliknya - penyisipan urutan ke dalam genom - berhasil tidak lebih dari 10% percobaan.
Berbagai efek menarik muncul saat mengedit. Misalnya, tikus mosaik, atau chimera, dilahirkan, yang memiliki sel dengan variasi berbeda dari genom ibu dan ayah. Cas9 dapat memotong DNA berkali-kali, tetapi pembawa pesan RNA yang mengkodekannya tidak abadi, dan larutan yang disuntikkan menghilang begitu saja dalam serangkaian pembelahan sel. Kadang-kadang editor masih menyala lagi setelah pronukleus menyatu dan telur telah dibagikan. Dan karena perbaikan DNA setelah pecah selalu merupakan proses acak dan penyembuhan tidak pernah terjadi dengan cara yang sama, maka beberapa sel dalam satu organisme akan mengandung mutasi lain.
Untuk sains dan kedokteran
Kami pindah ke ruang sebelah untuk melihat hasil langsung dari eksperimen pengeditan genom. Di rak di sebelah kiri - wadah berisi tikus hasil rekayasa genetika, di sebelah kanan - dengan hewan pengerat biasa untuk dikendalikan. Mereka tumbuh, seperti yang di kiri, tetapi genomnya tidak dimanipulasi. Tikus pengontrol diperlukan agar memiliki norma di depan mata kita dan membandingkan makhluk yang diperoleh dalam percobaan dengannya.
Pyotr Sergiev mengambil salah satu wadah dengan sepasang tikus abu-abu. Secara lahiriah, mereka benar-benar biasa, tetapi mereka tidak memiliki keturunan. Faktanya adalah bahwa pada pria gen salah satu RNA methyltransferases, suatu enzim yang hanya diproduksi dalam sperma, dimatikan. Laki-laki dengan gen yang tidak aktif dilahirkan dalam keadaan steril. Tujuan pasti dari gen dan enzim tersebut masih belum diketahui. Untuk mengetahuinya, dua strain tikus dibiakkan di laboratorium: yang satu dimatikan gennya, yang lain memiliki protein yang ditandai dengan editor genom.
“Mutasi pada gen ini juga ditemukan pada manusia - kemudian seorang pria menderita kemandulan. Tetapi sampai kami menemukan mengapa itu diperlukan, mengapa itu mengubah RNA, kami tidak akan dapat membantu pasien seperti itu,”alasan ilmuwan itu.
Faktanya, kita masih belum mengetahui fungsi dari kebanyakan gen manusia. Mengetahui hal ini adalah tugas mendasar yang diselesaikan oleh banyak kelompok penelitian di seluruh dunia, termasuk di Rusia. Genom tikus sangat mirip dengan manusia. Diharapkan dengan bantuan CRISPR-Cas, studi genom makhluk apapun akan berjalan lebih cepat.
Kelompok Sergiev bersama dengan N. N. NN Petrova mulai mencari mutasi yang mengarah ke beberapa jenis kanker. Rencana terdekat termasuk proyek untuk menciptakan hewan yang dimodifikasi secara genetik untuk pertanian bekerja sama dengan Institut Penelitian Peternakan Seluruh Rusia dan Institut Biologi Gen dari Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia.
“CRISPR-Cas adalah alat luar biasa yang memungkinkan Anda mengubah genom sesuai kebijaksanaan Anda, menjadi sedikit dari Tuhan. Pada akhirnya, tugas sains adalah memahami cara kerja makhluk kompleks seperti mamalia,”kata ilmuwan tersebut.
Memecahkan masalah fundamental sains itu bagus, tapi apa yang akan diberikan teknologi ini untuk pengobatan? Sayangnya, di masa mendatang tidak banyak. Mengedit telur dan membesarkan tikus yang dimodifikasi secara genetik itu mudah, tetapi tidak mungkin mengoreksi gen hewan dewasa, apalagi manusia.
Metode untuk mengedit DNA dalam somatik (yaitu, sel yang sudah terbentuk) masih sangat tidak efektif. Untuk memasukkan beberapa gen ke dalam sel, beberapa gen dimatikan melalui mutasi dan memaksanya untuk menghasilkan protein tertentu, Anda perlu mengeluarkan beberapa sel dari tubuh, mengedit DNA di dalamnya, dan memasukkannya kembali ke dalam tubuh. Pada prinsipnya, ada harapan bahwa dengan cara ini akan memungkinkan untuk melawan penyakit seperti distrofi otot Duchenne atau fibrosis kistik, bila diperlukan untuk mengembalikan kapasitas kerja beberapa bagian sel. Adapun predisposisi kanker, sejauh ini editor genom tidak berdaya. Jika gen mutan ditemukan pada seseorang, maka gen itu ditemukan di semua sel tubuh. Tidak realistis untuk mengubah semuanya. Dan setiap sel yang mengalami mutasi adalah sumber bahaya.
Tetapi bahkan jika CRISPR / Cas hanya akan membantu menjawab beberapa pertanyaan mendasar dan memungkinkan pengobatan penyakit genetik langka, itu masih akan menjadi langkah maju yang besar bagi umat manusia.
Tatiana Pichugina
