Rekayasa genetika membuka peluang bagi umat manusia untuk menciptakan organisme yang sebelumnya tidak ada dan menghancurkan penyakit genetik. Namun, semuanya tidak begitu cerah, karena bahkan terobosan teknologi CRISPR / Cas9 masih jauh dari sempurna. Kesalahan yang dia buat mungkin jarang terjadi, tetapi satu kesalahan saja sudah cukup untuk berakibat fatal bagi seseorang. Lenta.ru berbicara tentang apa yang salah dengan CRISPR dan bagaimana para ilmuwan berusaha memperbaiki situasinya.
Sistem CRISPR / Cas9 - semacam gunting DNA - dianggap sebagai revolusi di bidang rekayasa genetika. Dengan bantuannya, para ilmuwan dapat mengedit genom manusia, menghilangkan mutasi berbahaya darinya, dan dengan demikian mengobati penyakit keturunan yang tidak menyenangkan dan mematikan. Namun, orang tidak boleh berpikir bahwa tidak ada metode seperti itu sebelumnya. Di gudang ahli genetika, misalnya, nuklease yang mengandung "jari" seng, dan endonuklease - enzim yang memecah molekul DNA di tempat tertentu. Dalam hal akurasi, keserbagunaan, dan biaya, mereka jauh lebih rendah daripada CRISPR / Cas9, meskipun yang terakhir jauh dari sempurna.
CRISPR / Cas9 awalnya dibuat bukan oleh para ilmuwan, tetapi oleh alam. Ini adalah mekanisme molekuler yang ada di dalam bakteri dan memungkinkan mereka melawan bakteriofag dan parasit lainnya. Faktanya, ia bekerja sebagai kekebalan terhadap infeksi. CRISPR (singkatan dari "pengulangan palindromik pendek, berjarak teratur dalam kelompok") adalah daerah khusus (lokus) DNA. Mereka mengandung fragmen pendek virus DNA yang pernah menginfeksi nenek moyang bakteri masa kini, tetapi dikalahkan oleh pertahanan internal mereka. Potongan-potongan ini disebut spacer dan dipisahkan satu sama lain dengan mengulang urutan.
Ketika bakteriofag menyerang bakteri, setiap urutan berulang dan spacer yang berdekatan digunakan sebagai template untuk sintesis molekul yang disebut crRNA. Banyak rantai RNA yang berbeda terbentuk, mereka mengikat protein Cas9, yang tugasnya sangat sederhana: memotong DNA virus. Namun, ia akan dapat melakukan ini hanya setelah crRNA menemukan fragmen pelengkap DNA virus. Setelah Cas9 memecah asam nukleat asing, asam nukleat asing dihancurkan seluruhnya oleh nuklease lain.
CRISPR / Cas9 tepat untuk keakuratannya, karena bagi bakteri, fungsi sistem kekebalan yang benar adalah masalah hidup dan mati. Sistem "anti-virus" perlu menemukan bagian DNA virus di antara jutaan lainnya dan, yang paling penting, tidak membingungkannya dengan genomnya sendiri. Selama jutaan tahun evolusi, bakteri telah menyempurnakan mekanisme ini. Jadi segera setelah mereka mengetahui mengapa sistem CRISPR diperlukan, mereka menyadari bahwa itu dapat dijinakkan sebagai alat pengeditan gen yang akurat dan belum pernah terjadi sebelumnya.
Untuk mengganti satu wilayah spesifik dalam genom dengan yang lain, perlu dilakukan sintesis RNA pemandu, yang pada prinsipnya mirip dengan crRNA. Dia memberi tahu Cas9 di mana perlu membuat putus untai ganda dalam DNA dari organisme yang dimodifikasi. Namun, kita tidak perlu merusak gen, tetapi memodifikasinya - misalnya, mengganti satu atau lebih nukleotida dan menghilangkan mutasi berbahaya. Di sini alam datang untuk menyelamatkan lagi. Mekanisme perbaikan alami segera mulai memulihkan rantai potong. Triknya adalah untuk melakukan ini, beberapa fragmen RNA dihilangkan di dekat jeda, setelah itu urutan serupa disisipkan di sana. Para ilmuwan dapat menggantinya dengan urutan DNA mereka sendiri dan dengan demikian memodifikasi genomnya.
Representasi skematis CRISPR
Video promosi:
Gambar: Kaidor / Wikipedia
Namun, tidak ada yang sempurna. Terlepas dari keakuratannya, sistem CRISPR terkadang membuat kesalahan. Salah satu alasannya terletak pada sifat sistemnya. Tidak menguntungkan bagi bakteri jika crRNA bertepatan 100 persen dengan fragmen DNA virus, yang mungkin berbeda dengan satu atau dua nukleotida. Lebih baik baginya bahwa beberapa nukleotida bisa berbeda, yang memberi mikroorganisme kesempatan lebih baik untuk melawan infeksi. Pada saat yang sama, dalam rekayasa genetika, spesifisitas yang rendah mengancam kesalahan: perubahan dapat dilakukan di tempat yang salah. Jika ini terjadi selama percobaan pada tikus, maka tidak akan ada tragedi khusus, tetapi pengeditan genom manusia dapat berubah menjadi bencana.
Ini menjelaskan keprihatinan ilmuwan Barat tentang eksperimen yang sedang dilakukan di China. Peneliti Asia telah menggunakan teknologi CRISPR untuk memodifikasi embrio manusia secara genetik. Eksperimen semacam itu telah dilarang di Eropa dan Amerika Serikat, tetapi baru-baru ini Inggris mengizinkannya - semata-mata untuk tujuan penelitian. Embrio seperti itu harus dihancurkan dalam beberapa minggu setelah menerima, yang tidak termasuk "pembiakan" orang GM.
Namun, CRISPR / Cas9 tidak akan begitu bagus jika tidak bisa ditingkatkan. Jadi, para ilmuwan mengajari Cas9 untuk memotong bukan dua rantai sekaligus, tetapi hanya satu. Pemotongan dilakukan di dua tempat berbeda dalam sekuens DNA pada untaian berbeda, sehingga sistem harus mampu mengenali nukleotida dua kali lebih banyak dari biasanya, sehingga lebih akurat.
Protein Cas dan crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Ilmuwan di University of Western Ontario telah menemukan cara lain untuk meningkatkan teknologi ini. Mereka mencoba memecahkan masalah memperbaiki DNA yang terpotong. Pemulihan cepat rantai asam nukleat mengarah pada fakta bahwa para ilmuwan tidak punya waktu untuk mengoreksi genom mereka sendiri. Dengan demikian, lingkaran setan dibuat: rantai, diperbaiki dengan cara yang tidak diinginkan, harus dipotong lagi dengan protein Cas9.
Untuk mencegah hal ini terjadi, para peneliti memodifikasi gunting protein untuk membuat protein TevCas9. Ini memotong untai DNA di dua tempat, sehingga sulit untuk memperbaiki situs tersebut. Untuk mensintesis enzim baru, enzim I-Tevl ditambahkan ke Cas 9, yang juga merupakan endonuklease, yaitu protein yang membelah molekul DNA di tengah, daripada membelah ujung urutan, seperti yang dilakukan eksonuklease. Protein fusi yang dihasilkan ternyata lebih akurat dalam mengikat daerah tertentu dan kecil kemungkinannya untuk membuat kesalahan dan memotong daerah yang salah.
Struktur kristal Cas9 terikat pada DNA
Foto: Proyek wiki Cas9 / Wikipedia
Ada cara lain untuk meningkatkan akurasi sistem CRISPR. "Perlombaan senjata" antara bakteri dan virus tidak hanya mengarah pada pengembangan sistem pertahanan mikroorganisme, tetapi juga cara menetralisirnya. Dengan demikian, bakteriofag bermutasi dengan cepat, kehilangan area yang dikenali oleh kekebalan bakteri. Namun, beberapa kode untuk protein anti-CRISPR, mengganggu kerja kompleks crRNA-Cas9.
Pada 8 Desember, jurnal Cell menerbitkan sebuah artikel oleh para ilmuwan dari Universitas Toronto yang menciptakan "anti-CRISPR" - sebuah sistem yang memungkinkan Anda untuk mematikan mekanisme tersebut dalam kondisi tertentu. Ini mencegah kesalahan yang tidak diinginkan dengan menekan aktivitas Cas9 jika RNA panduan mengikat ke fragmen yang salah. Anti-CRISPR terdiri dari tiga protein yang menghambat nuklease dan dikodekan oleh gen salah satu virus bakteri.
Teknologi CRISPR telah digunakan untuk mengobati penyakit serius seperti leukemia dan kanker paru-paru, dan juga sedang diuji untuk membersihkan sel kekebalan HIV. Ketika para ilmuwan menemukan cara baru untuk meningkatkan metode ini, semakin banyak peluang untuk penerapannya akan terbuka.
Alexander Enikeev
